Роздільна здатність мікроскопа

118
Роздільна здатність мікроскопа

Оригінальну статтю можна прочитати за посиланням.

Автор:  Майкл В. Девідсон – Національна лабораторія сильного магнітного поля, Національний університет штату Флорида, Таллахассі, Флорида, 32310.

Роздільна здатність оптичного мікроскопа визначається як найкоротша відстань між двома точками на зразку, які все ще можуть бути помітні спостерігачам та камері як окремі об’єкти. Приклад цієї ​​концепції представлений на малюнку нижче, де точкові джерела світла від зразка виглядають як дифракційні кільця Ейрі в площині проміжного зображення мікроскопа.

Мал. 1. Патерни Ейрі та межа роздільної здатності Мал. 1. Патерни Ейрі та межа роздільної здатності

Межа роздільної здатності об’єктива мікроскопа — це здатність розрізняти два близько розташовані диски Ейрі на дифракційній картині (на Мал.1). Тривимірні позначення дифракційної картини поблизу площини проміжного зображення відомі як функція розсіювання точки та показані в нижній частині малюнка. Зображення зразка представлено серією близько розташованих точкових джерел світла, що утворюють візерунки Ейрі, і проілюстровано як в двох, так і в трьох вимірах.

Роздільна здатність є певною мірою суб’єктивною величиною в оптичній мікроскопії, оскільки при великому збільшенні зображення може виглядати нечітким, але все одно матиме максимальну роздільну здатність об’єктива. Числова апертура визначає роздільну здатність об’єктива, але загальна роздільна здатність усієї оптичної схеми мікроскопа також залежить від числової апертури конденсора. Чим вища числова апертура всієї системи, тим краща її роздільна здатність.

Правильне налаштування оптичної системи мікроскопа має великий вплив на забезпечення максимальної роздільної здатності. Конденсор повинен бути узгоджений з об’єктивом у відношенні числової апертури та регулюванні апертурної діафрагми для точного формування світлового конуса та освітленні зразка. Спектр довжини хвилі світла, який використовується для освітлення зразка, також є визначальним фактором у визначенні роздільної здатності, що має мікроскоп. Короткі хвилі забезпечують більшу роздільну здатність, ніж довгі. 

Існує кілька формул, які були для вираження залежності між числовою апертурою, довжиною хвилі та роздільною здатністю:

Де r — роздільна здатність (найменша дозволена відстань між двома об’єктами), NA — загальна числова апертура мікроскопа, λ — довжина хвилі, NA(obj) — числова апертура об’єктива, а NA(cond) — числова апертура конденсора. Де r — роздільна здатність (найменша дозволена відстань між двома об’єктами), NA — загальна числова апертура мікроскопа, λ — довжина хвилі, NA(obj) — числова апертура об’єктива, а NA(cond) — числова апертура конденсора.

Зверніть увагу, що рівняння (1) і (2) відрізняються коефіцієнтом збільшення, який становить 0,5 для рівняння (1) і 0,61 для рівняння (2).

Основою цих рівнянь є ряд факторів (включаючи різні теоретичні розрахунки, зроблені фізиками-оптиками) для пояснення роботи об’єктивів та конденсорів, але їх не слід розглядати як абсолютну величину якогось одного загального фізичного закону. У деяких випадках, таких як конфокальна та флуорисцентна мікроскопія, роздільна здатність може суттєво перевищувати межі, встановлені будь-яким із цих трьох рівнянь.

Інші фактори, такі як низький контраст зразка та неправильне освітлення, можуть призвести до більш низької роздільної здатності і, найчастіше, до реального максимального значення r (близько 0,25 мкм при довжині хвилі середнього спектру 550 нанометрів) та числової апертури 1,35 до 1,40 практично не реалізуються. У таблиці 1 надаємо список значень роздільної здатності (r) та числової апертури (NA) шляхом збільшення та корекції об’єктива.

Табл.1. Роздільна здатність та числова апертура по корекції об'єктива Табл.1. Роздільна здатність та числова апертура по корекції об’єктива

Коли мікроскоп ідеально налаштований, а об’єктиви узгоджені з конденсором, тоді ми можемо підставити числову апертуру об’єктива в рівняння (1) і (2), з додатковим результатом, що рівняння (3) зводиться до рівняння (2). 

Важливо відзначити, що збільшення не з’являється як фактор в цих рівняннях, оскільки лише числова апертура та довжина хвилі освітлення визначають роздільну здатність системи.

Як ми вже згадали (і це видно з рівнянь), довжина хвилі є важливим фактором роздільної здатності мікроскопа. Короткі довжини хвиль мають більш високу роздільну здатність (більш низькі значення r) і навпаки. Найбільшу роздільну здатність в оптичній мікроскопії досягає ближнє ультрафіолетове світло, найкоротша ефективна довжина хвилі зображення. За ближнім ультрафіолетовим світлом слідує синє, потім зелене і, нарешті, червоне світло, що дозволяє відрізняти деталі зразка. У більшості випадків для освітлення зразків використовують біле світло, згенероване вольфрамово-галогенною лампою. Спектр видимого світла зосереджений на довжині хвилі близько 550 нанометрів, що перевищує довжину хвилі зеленого світла (наші очі найбільш чутливі до зеленого світла). Саме ця довжина хвилі використовувалася для розрахунку значень роздільної здатності в таблиці 1. Значення числової апертури також важливе в цих рівняннях. Що вище числова апертура, то вище роздільна здатність. 

Вплив довжини хвилі світла на роздільну здатність при фіксованій числовій апертурі (0,95) наведено в таблиці 2 , причому більш довгі хвилі дають нижчий ступінь роздільної здатності.

Табл.2. Роздільна здатність в залежності від довжини хвилі Табл.2. Роздільна здатність в залежності від довжини хвилі

Роздільна здатність мікроскопа є найважливішою характеристикою оптичної системи та впливає на здатність розрізняти дрібні деталі конкретного зразка. Як обговорювалося вище, основним фактором, що визначає роздільну здатність, є числова апертура об’єктива, але також мають значення тип зразка, когерентність освітлення, ступінь корекції аберацій та інші фактори, наприклад такі як методика посилення контрасту або в оптичній системі, або в мікроскопі, або в самому зразку. 

У кінцевому підсумку –  роздільна здатність безпосередньо пов’язана зі збільшенням мікроскопа та межею сприйняття деталей зразка.